CDK13上调引起CircCDK13形成促进前列腺癌的发展
2022.01.20
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本期主要为大家推荐的一篇是关于circRNA海绵吸附作用于miRNA调节细胞周期蛋白依靠性激酶的表达,再通过探讨细胞周期蛋白依靠性激酶相关的转录因子来在前列腺癌中的作用。

前列腺癌是最常见的恶性肿瘤之一,也是导致男性癌症相关死亡的第二大原因。目前器官前列腺癌的主要治疗方法是通过前列腺切除术或放射治疗,但是转移性前列腺癌的治疗方法主要还是通过雄激素剥夺疗法。一旦出现激素耐受后,前列腺癌迅速发展,晚期前列腺癌通常在18个月内致命。所以需要进一步了解前列腺癌变和耐药的分子机制。

细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是丝氨酸/苏氨酸激酶,CDKs分子至少有13种,通过改变其活性来介导肿瘤相关的细胞周期絮乱,其中CDK12和CDK13研究颇多。在前列腺癌样本中,CDK12表达异常,表明CDK12缺失导致基因座的高度重复性增益从而参与细胞周期和DNA复制,而CDK13在前列腺癌中的研究较少

研究表明CircRNA在多种疾病中表达下调,通过海绵吸附作用miRNA在肿瘤的增殖、凋亡以及耐药等生物学过程中发挥独特的功能。因此本文作者通过设计内源性基因CDK13在转录水平上计划来调控转录因子E2F5的表达,从而促进CircCDK13的形成,海绵吸附作用于miR-212-5p/449a从而正反馈调控E2F5的表达来探讨前列腺癌的发展。

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33390186/,影响因子:7.038



01  CDK13在前列腺癌组织样本中高表达

作者选取30对前列腺癌组织和良性前列腺增生组织进行QPCR和WB验证,结果表明前列腺癌组织中的CDK12表达水平显著高于良性前列腺增生组织;从TCGA数据库中选取94例列腺癌组织数据和42例良性前列腺增生组织数据分析,所得结果跟QPCR和WB结果相一致。


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02  过表达CDK13促进前列腺癌细胞的增殖以及抑制细胞凋亡

用QPCR和WB的方法验证CDK13在四株不同前列腺癌细胞中的表达情况,相对于正常前列腺上皮细胞,CDK12在PC3和 22RV1细胞中表达显著升高;同时也进行HE和免疫组化实验,结果和QPCR、WB一样;在PC3和22RV1细胞中构建敲低和过表达稳转细胞株,通过CCK8,平板克隆形成实验检测增殖、以及流式检测凋亡,这些结果表明CDK13能促进前列腺癌细胞的增殖以及抑制细胞凋亡。


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03  CDK13促进E2F5在前列腺癌细胞中高表达

通过CoIP-MS实验,用CDK13调取相互作用蛋白,结果表明,共调取出10种蛋白,其中转录因子E2F5最有可能跟CDK13相互作用。用2对前列腺癌和正常前列腺上皮组织芯片观察E2F5的表达水平,结果表明E2F5在前列腺癌组织芯片中高表达;通过免疫共沉淀和免疫荧光,结果表明CDK13和E2F5在PC3细胞和前列腺癌组织中存在强烈的相互作用;作者也收集了30对癌组织和正常组织进行QPCR鉴定,以及在TCGA数据库中和应用免疫组化观察E2F5在组织中的表达情况,这些结果表明E2F5在前列腺组织中高表达。


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作者通过CRISPR-Cas9技术激活内源性CDK13转录和在PC12细胞中瞬转敲低以及过表达E2F5质粒观察CDK13、E2F5和p12基因表达水平,结果表明,相对于过表达E2F5质粒,敲低E2F5引起E2F5和CDK13的表达水平显著降低。作者接下来通过MTS实验、平板克隆形成实验以及蛋白pull down实验表明CDK13和E2F5相互作用并促进PC12和22RV1细胞的增殖。


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04  激活内源性CDK13转录引起CircCDK13的形成引起E2F5表达上调

作者发现在激活内源性CDK13转录细胞中的CDK13和E2F5蛋白表达水平呈正相关;在敲低CDK13细胞中观察E2F5蛋白水平显著降低,但是E2F5 mRNA表达水平无明显变化。在激活内源性CDK13转录细胞中发现CircCDK13高表达。接着作者通过观察过表达CircCDK13在PC12和22RV1的增殖情况,结果表明过表达CircCDK13能够促进细胞的增殖能力。


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05  CircCDK13海绵吸附作用miR-221-5p/449a调控E2F5蛋白表达

作者通过网站预测找出能够和CircCDK13相互结合作用的miRNA,通过RNA pull down结合RT-QPCR的方法确定miR-212-5p和miR-449a最有可能跟CircCDK13相互结合,然后通过双荧光素酶以及亚细胞定位最终确定它们的结合关系。最后通过合成miR-212-5p和miR-449a mimic看下游CDK13和E2F2蛋白表达情况,结果表明CDK13和E2F2蛋白表达水平显著减低。


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06  E2F2激活CDK13基因的转录并正反馈调控circCDK13的形成

过表达或者敲低E2F2在PC3细胞中,QPCR结果表明过表达E2F2后,CDK13和circCDK13 mRNA表达水平显著升高,反之则降低。通过网站预测CDK13基因和转录因子E2F2的结合位点,进行Chip和双荧光素酶实验,结果说明了CDK13和E2F2能够相互结合。接下来为了阐明CDK13-circCDK13-miR-212-5p/miR-449a-E2F5之间的调控关系对前列腺癌发展的影响,分别在PC3和22RV1细胞中共瞬转过表达circCDK13和过表达E2F5质粒观察E2F5、CDK13和p21的表达情况,结果表明E2F5和CDK13表达水平显著升高,而p21表达水平显著降低。最后敲低circCDK13和miR-212-5p/miR-449a mimic相互作用观察E2F5、CDK13和p21在PC3、22RV1细胞的表达情况和影响细胞增殖的情况,结果表明敲低circCDK13的同时过表达miR-212-5p/miR-449a,E2F5、CDK1蛋白表达水平显著降低,而p21表达水平显著升高,细胞的增殖速度也起到了抑制作用。


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07  CDK13-circCDK13-miR-212-5p/miR-449a-E2F5调节轴参与体内前列腺肿瘤的发生

为了明确CDK13-circCDK13-miR-212-5p/miR-449a-E2F5在前列腺肿瘤中的作用,作者构建了sh-circCDK13、sh-E2F5以及sh-circCDK13+sh-E2F5稳转细胞株用于接种动物,结果表明,sh-circCDK13和sh-E2F5共同作用后明显抑制了肿瘤的发展,肿瘤体积显著减少。同时WB检测肿瘤组织中相关蛋白表达水平和和tunel实验检测细胞凋亡情况,结果表明CDK13和E2F5蛋白表达水平显著降低,而p12蛋白表达显著升高。以上结果说明了同时抑制circCDK13和E2F5对前列腺肿瘤的发展起到抑制的作用。


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