CRISPR文库功能基因组筛选方案
CRISPR/Cas9系统是当今基因编辑领域最热门的明星工具，2013年，Broad研究所的两个研究团队分别在Science杂志同一期上发表了CRISPR文库的相关研究。在此之后，基于CRISPR/Cas9的工具得到了快速发展，CRISPRa，CRISPRi及CRISPR敲除文库已经广泛用于证明新的生物学机制，如耐药性和细胞存活信号。多篇CNS(Cell、Nature、Science)连续报道。利用该技术，研究人员在药物靶标发现、基因功能研究、药物敏感基因研究等领域取得了巨大的成功。
- 1.服务内容（以耐药基因为例）
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1）临床问题提出，选定合适的研究目标，确定研究癌种与目标药物。
2）个性化设计，全基因组筛选可能与药物发挥拮抗作用的基因。
3）高通量测序及候选基因筛选
4）候选基因功能验证：细胞水平、动物水平，临床相关性等
5）数据库检索寻找候选增敏基因的小分子抑制剂，如有可进行成药性研究，验证 药物协同作用。
- 2.一般筛选流程（耐药基因为例）
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- 3.筛选优点
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快速准确的找到与某种表型相关的基因靶点效率高应用范围广开发潜力大
- 4. 现有CRISPR筛选文库
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- 人源lncRNA 激活库 ·Human CRISPR lncRNA Activation Pooled Library (SAM-3) ·靶向激活10,504个lncRNA ·包含96,458个sgRNA靶点
- 人源敲除库 ·Human CRISPR Knockout Pooled Library (GeCKO v2) ·靶向敲除19,050个mRNA 及1864个miRNA ·包含123,411个sgRNA靶点
- 人源激活库 ·Human CRISPR Activation Library (SAM-2)·靶向激活23,430个mRNA·包含70,290个sgRNA靶点
- 小鼠敲除库 ·Mouse CRISPR Knockout Pooled Library (GeCKO v2) ·靶向敲除20,611个mRNA 及1175个miRNA ·包含130,209个sgRNA靶点
- 小鼠激活库 ·Mouse CRISPRa sgRNA library Caprano (P65-HSF) ·靶向激活22,774 (Set A), 22,658 (Set B) 个mRNA ·包含134,076个sgRNA靶点
- 其他 个性化定制 CRISPR/cas9 慢病毒文库
- 5.筛选案例
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1） 药物靶标发现
Molecular Cancer（If 7.776）杂志8月份在线发表了广州市第一人民医院的文章，伊马替尼（格列卫）是一种治疗白血病及胃肠道间质肿瘤的药物，但往往产生耐药，机制不明。在该研究中，研究人员运用CRISPR/Cas9全基因敲除文库在胃间质瘤中筛选并验证了9个可能参与伊马替尼耐药的基因，可以用于深入探讨伊马替尼耐药的分子机制。
筛选”耐药基因的思路
耐药基因筛选、差异基因的通路富集分析
耐药基因功能验证
Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in gastrointestinal stromal tumor with Imatinib resistance. Molecular Cancer. 2018; 17(1):121-127.
2018年4月份哈佛大学研究团队在Cell杂志发表了运用CRISPR激活文库筛选了化疗耐药相关的lncRNAs的研究论文。阿糖胞苷(Cytarabine, Ara-C)是一种治疗AML的药物，但往往产生耐药，机制不明。作者利用CRISPR文库原理构建了同时筛选有功能的mRNA、lncRNA的sgRNA筛选技术，通过“随机激活lncRNA、mRNA的转录表达”的方式，筛选针对AML的阿糖胞苷耐药RNA。最后发现lncRNA GAS6-AS2的激活会介导耐药的产生，并通过体内、外实验验证这一发现。
技术路线
耐药基因筛选策略、差异基因的通路富集分析
富集lncRNA的关联通路注释
GAS6-AS2耐药：体外功能验证，预后分析
GAS6-AS2耐药：体内验证
An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance. Cell. 2018; 173(3):649-664.e20.
2） 药物靶标发现
自噬是一种细胞内降解过程，需要多个自噬相关（ATG）基因的参与。在这个研究中，东京国立癌症中心研究所采用自噬流体报告基因GFP-LC3-RFP进行了全基因组CRISPR文库筛选，并鉴定出新的ATG家族基因TMEM41B，并发现TMEM41B与VMP1在自噬体形成的早期阶段一起发挥作用。
GFP-LC3-RFP全基因组筛选思路
TMEM41B敲除对自噬的影响
Genome-wide CRISPR screen identifies TMEM41B as a gene required for autophagosome formation. J Cell Biol. 2018; 217(11):3817-3828.
3） 肺转移基因筛选
Cell杂志发表的张峰团队的研究论文，该研究采用“全基因组CRISPR敲除文库”，经过慢病毒库扩增后，感染肺癌细胞株，经筛选后接种到裸鼠皮下，定期观察直至其肺部生成足量转移灶，取肺组织并提取基因组，PCR产物进行高通量测序获得肺转移相关基因，并进行实验验证。
筛选思路
肿瘤生长及转移情况
原发性肿瘤基因富集分析
转移瘤基因富集分析
单基因体内验证
Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 2015; 160(6):1246-60.
4）免疫相关基因筛选
哈佛大学医学院Dana-Farber癌症研究所等研究团队通过CRISPR文库体内筛选，鉴定出免疫相关基因Ptpn2，抑制Ptpn2可能会增强引起IFNγ反应的免疫疗法的效果，Ptpn2有望作为新的免疫治疗靶标。
筛选策略
体内实验验证筛选到靶标Ptpn2
Ptpn2缺失使肿瘤对免疫疗法敏感
In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 2017; 547(7664):413-418.
- 6.其他相关文献
1. A CRISPR screen identifies CDK7 as a therapeutic target in hepatocellular carcinoma. Cell Res. 2018.
2. Genome-wide CRISPR screen for PARKIN regulators reveals transcriptionalrepression as a determinant of mitophagy. Proc Natl Acad Sci. 2018.
3. An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance.Cell.2018.
4. Defining essential genes for human pluripotent stem cells by CRISPR-Cas9 screening in haploid cells. Nat Cell Biol. 2018.
5. TRRAP is essential for regulating the accumulation of mutant and wild-type p53 in lymphoma. Blood. 2018.
6. LKB1, Salt-Inducible Kinases, and MEF2C Are Linked Dependencies in Acute Myeloid Leukemia .Mol Cell. 2018.
7. Genome-wide CRISPR-Cas9 Screen Identifies Leukemia-Specific Dependence on a Pre-mRNA Metabolic Pathway Regulated by DCPS. Cancer Cell. 2018.
8. CRISPR-Cas9 screen reveals a MYCN-amplified neuroblastoma dependency on EZH2. J Clin Invest. 2018.
9. Genome-scale CRISPR-Cas9 Knockout and Transcriptional Activation Screening. Nature Protocols, 2017.
10. Genome-scale activation screen identifies a lncRNA locus regulating a gene neighbourhood. Nature, 2017.
11. Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. Elife, 2016.
12. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature biotechnology, 2016.
13. A genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks. Cell, 2015.
14. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell, 2015.
15. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science, 2015.
16. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature biotechnology, 2015.
17. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature, 2015.
18. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature, 2014.