miRNA研究思路

一．技术路线

二．研究内容

第一步 确定差异miRNA表达

        利用 RT-PCR 或者 RT-qPCR 检测 miRNA 在不同细胞或者组织中的表达水平。

第二步miRNA的功能研究

       探讨miRNA功能可用 gain/loss of function 策略，过表达或沉默 lncRNA 后观察表型。即研究 lncRNA 功能获得后或者功能缺失后对细胞增殖、凋亡、侵袭、转移与克隆形成，以及病毒的转录复制等的影响。

      （1）功能获得性研究

构建 miRNA 过表达质粒或者慢病毒、腺病毒包装载体。原则上是将全长miRNA 定向克隆到表达载体上实现miRNA 的过表达。

      （2）功能缺失性研究

可用 siRNA、shRNA、反义核酸、CRISPR/Cas9 等方法沉默 lncRNA，经 qRT-PCR 或 FISH 等验证后观察其对疾病相关基因表达和对细胞表型等的影响。

第三步 miRNA靶基因的预测

       通过miRBase， targetscan，starbase等在线网站预测可以与miRNA结合的靶基因，并通过间接实验和直接实验进行验证。

      （1）间接实验：通过WB或qPCR的方法检测miRNA过表达或抑制细胞株中靶基因的表达水平

      （2）直接实验：

       a. 双荧光素酶实验：

       b. EMSA

       c. CHIP

第四步 挽救实验

       假如miRNA对靶基因的调控是经典的负调控关系，miRNA过表达后会对细胞的某些功能表型产生影响，那么挽救实验就是将靶基因再过表达后看下这些功能表型能否逆转。

第五步 机制研究

       miRNA的作用机制类型很多，除经典的靶向负调控靶基因外，还有以下7种类型，需根据不同的机制选择不同的研究方法进行研究。

     （1）miRNA的前体pri-miRNA可翻译为多肽

     （2）miRNA可与其他功能蛋白相结合

     （3）miRNA可直接激活TLR受体蛋白（非改变表达量）

     （4）miRNA可提高蛋白表达水平

     （5）miRNA靶向调控线粒体相关基因mRNA

     （6）miRNA可直接激活基因转录过程

     （7）miRNA可靶向负调控其他非编码RNA的前体RNA

第六步 体内验证

      有条件的实验室可以继续通过动物实验，在体内或者临床样本水平进行验证。

参考文献：

      [1] Liu B. miR-200c/141 Regulates Breast Cancer Stem Cell Heterogeneity via Targeting HIPK1/β-Catenin Axis. Theranostics. 2018;

      [2] Cai C. miR-195 inhibits tumor progression by targeting RPS6KB1 in human 

prostate cancer. Clin Cancer Res. 2015;

      [3] Ge Q. miR-4324-RACGAP1-STAT3-ESR1 feedback loop inhibits proliferation and metastasis of bladder cancer. Int. J. Cancer. 2018; 

      [4] Shi DM. miR-296-5p suppresses EMT of hepatocellular carcinoma via attenuating NRG1/ERBB2/ERBB3 signaling. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2018;

      [5] Wang Y. Dysregulation of miR-6868-5p/FOXM1 circuit contributes to colorectal cancer angiogenesis. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2018.