外泌体研究整体方案
2019.05.09
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       2013年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家詹姆斯•罗思曼、兰迪•谢克曼以及德国科学家托马斯•祖德霍夫,以表彰他们发现细胞的囊泡运输调控机制。这使得外泌体相关研究成为学术界的大热门,大批科研工作者投入到研究外泌体研究的热潮中。


1. 外泌体简介

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      外泌体(Exosome)是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构,广泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等多种体液中。其内部包裹了蛋白、mRNA、miRNA和少量DNA等物质,这些生物活性物质可在细胞之间穿梭并介导细胞间的物质转运与信息交流,进而影响细胞的生理功能。部分肿瘤中的研究发现,有些miRNA会通过外泌体到达其他细胞组织,调控肿瘤侵袭、转移、耐药、微环境等。


2. 服务内容

       1)外泌体分离提取,包括血清、细胞培养上清、尿液等

       2)外泌体鉴定,包括透射电镜、流式细胞术、Western blot、纳米颗粒示踪等

       3)外泌体基因、蛋白检测分析技术(mRNA、miRNA、lncRNA、protein等)

       4)细胞功能以及动物实验验证外泌体的功能

       5)结合miRNA、lncRNA、功能蛋白等的研究方法检测外泌体的生物学功能以及作用机制

3. 外泌体提取

       外泌体的提取有试剂盒法,超速离心法,超滤法,三种方法都可提取血清、血浆和细胞培养上清的中的exosome,但不同的样本、不同实验需求,需要做适当调整。

       血清:若只用于芯片检测,推荐超速离心法,需样本0.5-1ml;若除了芯片检测,还需用于其它实验,推荐试剂盒法,需样本0.5-1ml;冻存样本为血清。

       血浆:若只用于芯片检测,推荐超速离心法,需样本0.5-1ml;若除了芯片检测,还需用于其它实验,推荐试剂盒法,需样本0.5-1ml;冻存样本为血清。

       细胞上清(FBS):推荐超滤法,需培养上清150-200ml。

       细胞上清(FBS-free):推荐试剂盒提法,需培养上清50-80ml。

       细胞上清(exosome-free FBS):推荐试剂盒提法,需培养上清50-80ml。

4. 外泌体鉴定

       透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope)及纳米颗粒示踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis)确证大小,免疫印迹(Western blot)验证标记蛋白CD9/CD63/CD81/HSP70。

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5. 案例展示

       Title:Exosomal miR-1290 and miR-375 as prognostic markers in castration-resistant prostate cancer

       Journal:EUR UROL

       Impact factor:17.298

       目的是研究外泌体中的miRNA能否对前列腺癌患者的预后情况进行评估,首先通过对多个前列腺患者的血浆外泌体进行高通量测序,分析得到miR-375和miR1290有显著的差异表达,并与前列腺癌预后有显著关联。然后通过QPCR的方法对高通量测序结果进行验证。为前列腺癌的诊断标志物研究提供新的论据。

技术路线

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结果展示

      1. 通过外泌体高通量测序数据分析发现已知的microRNA 375个,未知的microRNA 57个;选择稳定表达的micorRNA-30a-5p和micorRNA-30e-5p作为定量PCR检测验证的内参。

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外泌体RNA种类及含量分布图

2. 高通量测序分析出差异表达基因中,通过QPCR方法验证得到生存相关性的三个microRNA(microRNA-1290、microRNA-1268和microRNA-375)。其中microRNA-1290和microRNA-375与前列腺病人生存周期相关。通过临床预后模型分析miR-1290和miR375,发现这两个血浆外泌体的microRNA可作为去势抵抗性前列腺癌病人有效预后监测的分子标记物。

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Kaplan-Meier存活函数法预后分析


参考文献

Huang X, Yuan T,et al. Exosomal miR-1290 and miR-375 as prognostic markers in castration-resistant prostate cancer.Eur Urol. 2015 Jan;67(1):33-41.


 


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