EIF4A3诱导circASAP1通过NRAS/MEKA/ERK1/2信号促进胶质母细胞瘤的肿瘤发生和替莫唑胺耐药
2020.11.13
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这次分享关于南京医科大学神经外科团队在NEURO-ONCOLOGY杂志上发表一篇题为“EIF4A3-induced circular RNA ASAP1(circASAP1) promotes tumorigenesis and temozolomide resistance of glioblastoma via NRAS/MEK1/ERK1/2 signaling”的文章,研究发现真核起始因子eIF4A3诱导的circASAP1通过sponge miR-502-5,上调NRAS表达水平,通过MEK1/ERK1/2信号通路调节多形性胶质母细胞瘤GBM的增殖,从而促进胶质母细胞瘤的肿瘤形成。


案例文章


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IF:10.247


胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤,其中一半以上是胶质母细胞瘤,也称为多形性胶质母细胞瘤,是中枢神经系统最恶性的肿瘤。尽管经过最大限度的诊断治疗后,患者存活期还是不会超过15个月。有研究表明烷基化药物替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)的国际标准化疗药物。目前还发现细胞内一些非编码RNA也能对原发性脑肿瘤起到一定的抑制作用。本研究团队发现通过用TMZ对多形性胶质母细胞处理后,发现circular RNA ASAP1(circASAP1)高表达,进一步研究发现是EIF4A3诱导的环状RNA ASAP1(circASAP1)是通过NRAS/MEK1/ERK1/2信号促进胶质母细胞瘤的肿瘤发生和替莫唑胺耐药。


结果


❶ circASAP1在TMZ处理过的GBM细胞和组织中高表达

收集3对均用替莫唑胺治疗过的原发性和复发性胶质母细胞瘤患者组织标本进行RNA-seq,生信分析结果表明两组样本中有相同的33种circRNA上调,23种circRNA下调,通过比较发现circASP1在复发性胶质母细胞瘤患者组织高表达。作者还通过培养2株耐TMZ的GBM原代细胞系和2株对TMZ不敏感的原代细胞系分析circASP1的表达量与TMZ有直接的关系,分析circASP1核酸结构设计引物,运用普通PCR和qPCR技术对耐TMZ GBM细胞中circASP1定性、定量研究,确定了在耐TMZ的GBM细胞系和组织中,circASP1表达量显著上调。


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❷ circASP1对GBM细胞增殖以及细胞耐TMZ的影响

q-PCR、CKK-8检测法检和克隆形成实验测各组过表达circRNA的转染效率,筛选出两组过表达circRNA(sh-circASP1-2、sh-circASP1-3)作为TUNNEL法测细胞凋亡和用WB法检测各组细胞凋亡标志物的蛋白水平。结果表明敲低circASP1在细胞中的表达水平能抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡以及耐TMZ低下。


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❸ EIF4A3促进circASP1的表达

通过circinteractome数据库,作者发现circASP1 mRNA上游存在四个eIF4A3结合位点;RIP实验证明eIF4A3可以结合下游b,c和d部分的序列,但不结合circASP1和上游a的序列;体外构建含有eIF4A3结合位点的RNA转录本进行pull-down实验,证明越多的eIF4A3结合位点,越有利eIF4A3和circASP1 mRNA的结合。通过敲低eIF4A3表达明显抑制circASP1的表达,而过表达eIF4A3明显促进circASP1的表达,表明了eIF4A3能结合circASP1 mRNA下游序列,促进8和12号外显子的环化,从而使circASP1的表达增加。


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❹ miR-502-5p海绵吸附CircASAP1 

FISH分析发现,circASP1主要分布在胞浆之中,故作者猜测其在GBM中发挥作为miRNAsponge的作用,接着利用生物信息学分析发现,只有miR-502-5p含有circASP1的结合位点;双荧光素酶报告基因实验证明,miR-502-5p与circASP1存在相互结合作用;RT-qPCR和TUNNEL实验结果发现,circASP1是通过miR-502-5p调节细胞凋亡。


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❺ miR-502-5p靶向调控NRAS

结合对GBM组织的RNA-seq和pudmed上已报道的miR-502-5p靶向基因分析,挖掘到miR-502-5p的一个靶向基因是NRAS;双荧光素酶报告基因实验证明,miR-502-5p与NRAS存在相互结合作用;在rescue实验中,WB结果证明circASP1通过miR-502-5p上调NRAS的表达。


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❻ CircASAP1 通过NRAS/MEK1/ERK1/2 促进肿瘤增殖和TMZ耐药

克隆形成实验证明敲低NRAS明显抑制GBM细胞的增殖和降低其耐TMZ性,但同时给予过表达circASP1可以逆转该抑制效果。通过WB的方法对同时转染过表达circASP1和给予miR-502-5p抑制剂检测MEK1/ERK1/2信号中相关蛋白的蛋白表达水平,结果表明,circASP1的过表达促进MEK1/ERK1/2信号通路的激活对细胞的增殖以及耐TMZ性起到调控作用。作者还发现过表达circASP1的GBM细胞在小鼠体内成瘤能力明显增强,但敲低circASP1过表达的同时给药TMZ能抑制成瘤能力,也能够提高小鼠的存活率。


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总结

本研究说明了circASAP1在替莫唑胺耐药中起重要作用,是预测患者预后和进行治疗干预的潜在靶点,有助于我们对GBMs发病机制的理解以及为提供治疗GBMs的技术手段提供一定的理论知识。




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