lncRNA相关研究整体思路11
2019.08.20
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lncRNA研究思路

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第一步 确定差异lncRNA表达

       利用 RT-PCR 或者 RT-qPCR 检测 lncRNA 在不同细胞或者组织中的表达水平。

第二步 探究 lncRNA 特点

     (1)通过 QD-FISH 原位杂交技术定位;或者通过细胞核质分离试剂盒得到 RNA,qRT-PCR 检测其分布;

     (2)全长序列试验方法:通过 5′RACE 获取 lncRNA5′ 全长, 3′RACE 获取 lncRNA3′ 全长,最终得到 lncRNA 完整的全长序列。

第三步lncRNA的功能研究

      lncRNA 较长,承载的信息量多,更容易形成高级结构,其功能具有多样化和特异性强的特点。类似于 miRNA,探讨 lncRNA 功能可用 gain/loss of function 策略,过表达或    沉默 lncRNA 后观察表型。即研究 lncRNA 功能获得后或者功能缺失后对细胞增殖、凋亡、侵袭、转移与克隆形成,以及病毒的转录复制等的影响。

    (1)功能获得性研究

      构建 lncRNA 过表达质粒或者慢病毒、腺病毒包装载体。原则上是将全长 lncRNA 定向克隆到表达载体上实现 lncRNA 的过表达。然而有些 lncRNA 很大或全长尚未分离,这时将视 lncRNA 在基因组上的定位采取不同的研究策略。在构建 lncRNA 表达质粒时,需关注 lncRNA 是否在蛋白编码基因的启动子区域或 3′-UTR 区域,勿遗漏重要区段。

     (2)功能缺失性研究

      可用 siRNA、shRNA、反义核酸、CRISPR/Cas9 等方法沉默 lncRNA,经 qRT-PCR 或 FISH 等验证后观察其对疾病相关基因表达和对细胞表型等的影响。

第四步 机制研究

      lncRNA 可与蛋白质、DNA 和 RNA 相互作用,但是目前最常用的还是利用体外转录、RNA pull down、RNA-RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation)、CHIRP-seq(Chromatin isolation by RNA Purification)、MS 等技术手段。

第五步 表达调控

      将 lncRNA 表达与其他领域相结合,解释其调控机理。(1)DNA 甲基化和乙酰化:可通过检测相应基因甲基化、乙酰化差异与 lncRNA 结合分析。(2)转录因子:研究 lncRNA 与转录因子的调控机制。

第六步 体内验证

      有条件的实验室,可以继续在体内或者临床样本水平进行验证。

lncRNA的作用机制不清楚,lncRNA 的功能非常难研究。当前很多通过研究 miRNA 与 lncRNA 的调控关系来揭示非编码 RNA 的功能,最热门的要数 ceRNA 调控网络。相关的可利用资源包括:

    (1)starBase 平台构建了最全面的 CLIP-Seq 实验支持的 miRNA 和 lncRNA 的调控关系网络,包括构建了 ceRNA 调控网络 。

    (2)DIANA-LncBase 数据库 只是构建了基于单个 CLIP-Seq 数据的 miRNA 和 lncRNA 调控关系。

参考文献:

     [1] Chang ZW. LncRNA-TUSC7/miR-224 affected chemotherapy resistance of esophageal squamous cell carcinoma by competitively regulating DESC1. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2018;

     [2] Chen Y. HOXD-AS1/miR-130a sponge regulates glioma development by targeting E2F8. Int. J. Cancer. 2018;

     [3] Jia L. LINC01296/miR-26a/GALNT3 axis contributes to colorectal cancer progression by regulating O-glycosylated MUC1 via PI3K/AKT pathway. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2018;

     [4] LncRNA XIST/miR-34a axis modulates the cell proliferation and tumor growth of thyroid cancer through MET-PI3K-AKT signaling. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2018;

     [5] Exosome-mediated transfer of lncRUNX2-AS1 from multiple myeloma cells to MSCs contributes to osteogenesis. Oncogene. 2018.

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