非编码基因调控转录因子的研究思路
2020.08.19
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中国医科大学最近发表了一篇7分的文章,

我们一起来学习一下吧~

《LINC00665可以被TAF15S延长半衰期,并通过STAU1介导的mRNA降解阻止了胶质瘤细胞的癌变》


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为了寻找神经胶质瘤中lncRNA及其有关的治疗靶标,作者从临床样本和癌细胞株的RNA表达谱中筛选到了一批神经胶质瘤的差异表达基因,通过数据库筛选和软件预测了这些基因之间的结合位点。RNA-IP、ChIP和双荧光素酶机制实验验证了互作关系,RNA和蛋白的表达也做了基因之间的调控关系。最后,通过动物实验验证了lncRNA相关的3个基因组合抑癌效果最优,具有成为治疗靶标的价值。



01、文章亮点

通过引入了一个转录后调控的关键蛋白——STAU1,把lncRNA调控下游转录因子的关系串联在一起;lncR665可以被上游的TAF15调控,同时lncR665调控转录因子MTF1和YY2的降解。


02、涉及的调控机制

✦ TAF15可以延长lncR665的半衰期;

✦ lncR665可以与促癌基因YY2和MTF1转录因子结合配对;

✦ lncR665在双链RNA结合蛋白STAU1的帮助下,lncR665可以使YY2和MTF1的mRNA降解;

✦ YY2和MTF1是细胞周期蛋白GSTE1的转录因子,YY2和MTF1启动GSTE1的表达;


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调控机制图


03、实验思路

➀发现抑癌基因TAF15(转录因子)


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图1A-C正常组织/正常细胞相比,肿瘤的TAF15表达水平更低,肿瘤分级越高,TAF15越低。


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补充图1a:TAF15低表达患者组生存期更短。


➁ 发现抑癌基因lncR665


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补充图2:lncRNA表达谱分析:癌细胞比正常细胞的lncR665表达水平更低,TAF15高表达细胞株的lncR665表达水平也更低。


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图1 D:FISH定位,看正常细胞比肿瘤细胞的lncR665(红色)更多;

图1 E:QPCR水平,看正常细胞比肿瘤细胞 lncR665表达更多;

图1 F:cck8检测,肿瘤细胞过表达TAF15增殖下降,肿瘤细胞过表达lncR665增殖下降, 肿瘤细胞同时过表达TAF15和 lncR665,增殖进一步下降。


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图1 G:凋亡检测,图1 H:细胞侵袭

肿瘤细胞过表达TAF15凋亡增加,侵袭减少,

肿瘤细胞过表达lncR665凋亡增加,侵袭减少, 

肿瘤细胞同时过表达TAF15和 lncR665,凋亡进一步增加,侵袭减少。


➂ TAF15与lncR665存在相互作用


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图2 A:QPCR检测,肿瘤细胞过表达TAF15,lncR665增加; 

图2 B:RNA IP+QPCR检测,肿瘤细胞 TAF15可以与lncR665共沉淀; 

图2 C:RNA pulldown+WB检测,肿瘤细胞 lncR665可以pull down TAF15; 


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图2 D:新生RNA捕获 + QPCR检测,肿瘤细胞过表达TAF15,新生lncR665不变; 

图2 E:RNA聚合酶抑制剂+QPCR检测,肿瘤细胞过表达TAF15, lncR665 半衰期延长; 


➃ 发现MTF1和YY2是促癌基因


➄ STAU1和lncR665、MTF1(转录因子)和YY2(转录因子)存在调控关系


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图3A-B:在QPCR和WB水平,lnR665过表达时,MTF1减少;STAU1过表达时,MTF1增加;lnR665和STAU1同时过表达时,MTF1恢复。

图3C:RNA IP+QPCR检测,STAU1可以拉取lncR665或MTF1。

图3D:双荧光素酶检测,lncR665结合MTF1的3’UTR 。


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图3EQPCR检测lncR665使MFT1半衰期缩短,STAU1使MFT1半衰期缩短延长; 

图3G-Icck8、凋亡、侵袭实验,肿瘤细胞过表达MTF1,可以挽救LncR665的抑癌作用。


➅ 预测并验证MTF1和YY2可以启动细胞周期蛋白GTSE1的转录


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图7A:生信预测+ChIP+PCR验证MTF1结合GTSE1的启动子区;

图7B-C:敲除或过表达MTF1细胞株,QPCR和WB验证,MTF1和GTSE1有正相关趋势;


➆ 生信分析临床数据验证发现MTF1、YY2和GTSE1高表达都与预后不良相关


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➇ 体内验证TAF15+lncR665+MTF1-或YY2- 3个组合的抑癌效果最优


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图8 A-C :TAF15+或lnc665+都是抑癌;MTF1-或YY2-都是抑癌;TAF15+lncR665+MTF1-或YY2-抑癌效果最优。


⑨ 体内验证GTSE1-也有明显抑癌效果


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注:为了方便理解,以上按照作者的推测标出了抑癌基因和促癌基因)



04、点评

以lncR665为中心,研究者讲明了临床预后有关的分子TAF15-lncR665-MTF1/YY2-GTSE1通路。美中不足的是,研究者没有lncR665差异表达的临床预后分析结果,而且在其他肿瘤类型中,lncR665是促癌基因,和本研究结论相反。



最后两张表格总结这篇文章的实验思路和实验方法

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