miRNA/LncRNA/circRNA过表达载体构建
2019.08.27
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      MicroRNA (miRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子,它们在动植物中参与转录后基因表达调控。到目前为止, 在动植物以及病毒中已经发现有28645个miRNA 分子 。大多数miRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster) 的形式存在于基因组中 。


       环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子(在活体中有时也有表达),也是RNA领域最新的研究热点。早在 20 世纪八十年代即有研究报道,但由于它们表达丰度低,文献报道较少,一直被认为是 RNA 转录剪切的罕见错误而被忽视。circRNA分子呈封闭环状结构,不受RNA外切酶影响,表达更稳定,不易降解。在功能上,近年的研究表明,circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点,在细胞中起到miRNA海绵( miRNA sponge)的作用,进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用,升高靶基因的表达水平;这一作用机制被称为竞争性内源RNA(ceRNA)机制。通过与疾病关联的miRNA相互作用, circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。


       LncRNA是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。研究表明, lncRNA 在剂量补偿效应(Dosage compensationeffect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用,成为遗传学研究热点


       表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等),使目的基因能够表达的载体。表达载体分为慢病毒载体与非慢病毒载体。以下主要介绍慢病毒载体:


原理:

       将外源基因片段插入到慢病毒载体的多克隆位点。慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞, 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,使用慢病毒载体,能大大提高目的基因或目的shRNA的转染效率,且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加,能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。


技术路线:

1. 目的基因调取。

2. 慢病毒载体插入目的基因。

3. 转化培养。

4. 克隆筛选及鉴定。

5. 无内毒素质粒提取。


客户需提供:

1. miRNA、LncRNA、circRNA信息。如:已知NCBI编号,基因序列。

2. cicrRNA需提供环化位点信息。


我们的服务:

1. 基因合成。

2. 载体设计。

3. 过表达构建及鉴定报告。

4. 出货质粒,甘油菌。

5. 载体更换。

6. cDNA文库制备。

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LncRNA及miRNA慢病毒过表达图谱                                  CircRNA慢病毒过表达图谱


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