JEV:神经母细胞瘤分泌携带miR-375的外泌体促进骨髓间充质基质细胞的成骨分化
2020.10.20
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近期,意大利的耶稣圣婴儿童医院的Angela Di Giannatale团队研究发现神经母细胞瘤来源外泌体携带miR-375,远端转移到骨髓创造有利的环境,从而促进骨转移,该研究结果发表于Journal of Extracellular Vesicles 。


01  案例文章


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骨髓是神经母细胞瘤(neuroblastoma ,NB)转移的靶器官,NB侵袭骨髓的机制仍然是未知的。肿瘤微环境在肿瘤发生发展中扮演着重要作用,间充质基质细胞被认为是肿瘤间质的组成部分。与NB患者(无骨髓转移)相比,骨髓转移NB患者的骨髓间充质基质细胞(BM-MSCs)展现出较强的成骨分化潜能。骨髓转移的的NB细胞分泌的外泌体高表达miR-375,促进BM-MSCs成骨分化。临床数据显示,miR-375高表达与NB患者骨髓转移相关。结果表明,外泌体miR-375在骨髓创造一个有利的微环境从而促进肿瘤转移。miR-375作为一个新的生物标志物,也是NB患者发生骨髓转移的潜在靶标。


02  案例文章的研究内容


✦ NB 和 BM 转移患者的BM-MSCs 有较强的成骨分化潜力

分别从12个NB患者(8个骨转移,MBM-MSCs;4个无骨转移,NMBM-MSCs)和7个健康人(HC-MSCs)分离MSCs。流式分别检测MSCs标志物(CD90,CD105, CD81, CD9 )和NB细胞表面标志物(GD2)均为阳性;造血干细胞标志物(CD34, CD45 )和神经元标志物(CD56),为阴性。原代分离的3组MSCs群体倍增时间无差异。成骨分化和qPCR检测成骨分化相关因子(RUNX2, OSTERIX,BMP2,SPP1),MBM-MSCs 有较强的成骨分化潜能。


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✦ BM转移的NB细胞来源外泌体增强HC-MSCs的成骨分化

分别从原代肿瘤细胞(IMR-32 and IGR-NB8 cells )和BM转移的NB细胞(SKNSH, SHSY5Y, SKNBe2 c,LAN-1 and IGR-N91 )分离外泌体。IMR32 exo和SHSY5Y-derived exo分别与HC-MSCs共培养24h,共聚焦成像、qPCR检测、WB检测和成骨诱导表明,与IMR32 exo 组(原位肿瘤细胞)相比,SHSY5Y-derived exo组(骨转移来源肿瘤细胞)MSCs内化的外泌体、骨分化相关因子(RUNX2, OSTERIX,BMP2,SPP1)和钙沉积被显著提高;


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✦ miR-375在BM-metastasisNB细胞来源的外泌体和MBM-MSCs中高表达

RT-qPCR分别检测7个NB细胞(IMR-32,IGR-NB8 cells,SKNSH, SHSY5Y, SKNBe2 c,LAN-1,IGR-N91 )来源的外泌体miRNA表达。与原代肿瘤细胞来源外泌体相比,骨转移NB细胞来源外泌体中,miR-375, miR-365a-3p, miR-193b-3p, miR-18a-3p, miR-140-5p 表达上调;另外,在MBM-MSCs 或SHSY5Y-exosomes /HC-MSCs 共培养模型中,miR-375也显著上调。


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靶标预测显示,YAP1 和DEPTOR 可能是miR-375 的潜在靶点,YAP1参与Hippo 信号通路,抑制RUNX2的活性(成骨细胞成熟必须的因子)。因此,作者推测NB分泌的外泌体携带miR-375到骨髓通过抑制YAP1促进成骨分化。在骨转移来源的NB 细胞中,YAP1 的mRNA和蛋白水平显著低于原位肿瘤细胞;不同肿瘤细胞来源的外泌体与HC-MSCs共培养,SH5YSY-derived exosomes 组YAP1和DEPTOR 的mRNA、蛋白水平显著降低。在MBM, NMBM- 和HCMSCs ,YAP1 的mRNA和蛋白表达在MBM-MSCs中也显著降低。


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✦ MiR-375调控成骨转化因子的表达

分别构建了MiR-375过表达NMBM-MSC细胞,及MiR-375下调MBM-MSC 细胞。RT-qPCR结果表明,MiR-375过表达显著下调YAP1的mRNA和蛋白水平,然而成骨标志物SPP1 and OSTERIX 显著上调。相反的,抑制miR-375可以上调YAP1和DEPTOR 的mRNA和蛋白表达。


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✦ MiR-375表达与NB患者的骨疾病相关 

为了探索MiR-375与NB患者骨髓浸润的相关性,17个HC,7个NMBM 患者和14个MBM患者的外周血来源的外泌体被收集,Q-PCR 分别检测患者及患者血清来源的外泌体,在MBM组,MiR-375的表达上调。随后27个NMBM和33个MBM患者的骨髓样本被收集, 突触素(观察NB细胞的侵袭)、miR-375 表达水平被评估;miR-375 不仅在NB细胞中表达也在成骨及骨髓的其他细胞中表达。miR-375 在NB患者的临床相关性分析显示,miR-375阳性与NB患者发生骨转移正相关。在SCID小鼠模型中,PKH26 标记的外泌体可以转移到骨髓,并且外泌体注射组miR-375表达显著升高。


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总之,本研究阐明了神经母细胞瘤通过外泌体中的miR-375,促进骨髓间充质基质细胞的成骨分化。



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