1. CRISPR/cas9文库简介

          2013年以来，CRISPR/cas9技术凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，已迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手，是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现得第三代“基因组定点编辑技术”。

         CRISPR/cas9系统最初在大肠杆菌基因组中被发现，是细菌中抵抗外援病毒得免疫系统。CRISPR/cas9系统由两部分组成，一部分是用来识别靶基因组得，长度为20bp左右得sgRNA序列，另外一部分是存在于CRISPR位点附近得双链DNA核酸酶-Cas9，能在sgRNA得引导下对靶基因进行切割，最终通过细胞内得非同源性末端连接机制（NHEJ）和同源重组修复机制（HDR）对形成断裂的DNA进行修复，从而形成基因的敲除和插入，最终实现基因的（定向）编辑。

     与前两代技术相比，CRISPR-Cas9技术最大的突破是不仅可以对单个基因进行编辑，更重要的是可以同时对多个基因进行编辑，这也为全基因组筛选提供了有效的方法。

2. CRISPR/cas9文库种类

1）CRISPR/cas9敲除文库:

 

2）CRISPR/cas9激活文库:

  

3）人源lncRNA激活库

4) 定制CRISPR/cas9文库

靶位点确认及sgRNA文库设计；

sgRNA文库芯片合成；

sgRNA文库构建；

QC验证文库质量。

3. CRISPR/cas9文库筛选流程

4. CRISPR/cas9文库应用实例

1）阳性选择，通过随机诱变收集具有生长优势的群体。

 

  

2）阴性选择，确定特定条件下生存的必须基因，如果一个细胞携带了靶向生存必须基因的gRNA，那么敲除后的细胞不能存活。

3）案例展示

1. Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis

 

采用“全基因组CRISPR敲除文库”，经过慢病毒库扩增后，病毒库感染肺癌细胞株，经筛选后接种到裸鼠皮下，定期观察直至其肺部生成足量转移灶，取肺组织并提取基因组DNA，通过PCR技术扩增sgRNA靶序列，高通量测序获得转移靶基因。

 

2. A genome-scale CRISPR-Cas9 screening in myeloma cells identifies regulators of immunomodulatory drug sensitivity

    利用CRISPR-Cas9技术，在多发性骨髓瘤细胞中进行了全基因组筛选，寻找能够进一步提高免疫调控类药物疗效的潜在靶点。该文章使用的GeCKOv2文库能针对细胞内的19050条基因（每条基因被6条sgRNA所靶向）和1864条微RNA（每条微RNA被4条sgRNA所靶向），这能确保筛选的覆盖率。通过如下筛选流程：CRISPR-Cas9文库扩增--感染MM1S细胞--使用泊马度胺进行药物筛选--收取药物筛选7d，14d，21d的实验组及对照组细胞进行高通量测序。发现多发性骨髓瘤对亚胺类药物产生耐药的机制，并针对多发性骨髓瘤对提出了新的治疗方案，以增强对亚胺类药物的敏感性或克服耐药性。

3.Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in gastrointestinal stromal tumor with Imatinib resistance

         伊马替尼（格列卫）是一种治疗白血病及胃肠道间质肿瘤的药物，但往往产生耐药，机制不明。在该研究中，研究人员利用CRISPR-Cas9全基因敲除文库技术筛选针对胃间质瘤的伊马替尼耐药的基因。

5. CRISPR/cas9文库应用拓展，与新药筛选，整体课题进行链接

新药筛选：基因与药物

整体课题：肿瘤相关基因经典研究方案

6. 参考文献

1）Chen S, Sanjana NE, Zheng K, et al.Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis.Cell. 2015 Mar 12;160(6):1246-60.

2）Liu J, Song T, Zhou W, et al.A genome-scale CRISPR-Cas9 screening in myeloma cells identifies regulators of immunomodulatory drug sensitivity.Leukemia. 2019 Jan;33(1):171-180.

3）Cao J, Wei J, Yang P, et al.Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in gastrointestinal stromal tumor with Imatinib resistance.Mol Cancer. 2018 Aug 13;17(1):121.