全基因库筛选/功能基因组学
2019.08.19
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1. CRISPR/cas9文库简介

          2013年以来,CRISPR/cas9技术凭借着成本低廉,操作方便,效率高等优点,已迅速风靡全球的实验室,成为了生物科研的有力帮手,是继“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现得第三代“基因组定点编辑技术”。

         CRISPR/cas9系统最初在大肠杆菌基因组中被发现,是细菌中抵抗外援病毒得免疫系统。CRISPR/cas9系统由两部分组成,一部分是用来识别靶基因组得,长度为20bp左右得sgRNA序列,另外一部分是存在于CRISPR位点附近得双链DNA核酸酶-Cas9,能在sgRNA得引导下对靶基因进行切割,最终通过细胞内得非同源性末端连接机制(NHEJ)和同源重组修复机制(HDR)对形成断裂的DNA进行修复,从而形成基因的敲除和插入,最终实现基因的(定向)编辑。

     与前两代技术相比,CRISPR-Cas9技术最大的突破是不仅可以对单个基因进行编辑,更重要的是可以同时对多个基因进行编辑,这也为全基因组筛选提供了有效的方法。

2. CRISPR/cas9文库种类

1)CRISPR/cas9敲除文库:


表格1.jpg 


2)CRISPR/cas9激活文库:


表格2 (2).jpg

  

3)人源lncRNA激活库


表格3 (2).jpg



4) 定制CRISPR/cas9文库

靶位点确认及sgRNA文库设计;

sgRNA文库芯片合成;

sgRNA文库构建;

QC验证文库质量。


3. CRISPR/cas9文库筛选流程


图1.png


4. CRISPR/cas9文库应用实例

1)阳性选择,通过随机诱变收集具有生长优势的群体。


 图2.png

  

2)阴性选择,确定特定条件下生存的必须基因,如果一个细胞携带了靶向生存必须基因的gRNA,那么敲除后的细胞不能存活。



图3.png



3)案例展示

1. Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis



图4.jpg

 


采用“全基因组CRISPR敲除文库”,经过慢病毒库扩增后,病毒库感染肺癌细胞株,经筛选后接种到裸鼠皮下,定期观察直至其肺部生成足量转移灶,取肺组织并提取基因组DNA,通过PCR技术扩增sgRNA靶序列,高通量测序获得转移靶基因。

 

2. A genome-scale CRISPR-Cas9 screening in myeloma cells identifies regulators of immunomodulatory drug sensitivity


图5.jpg



    利用CRISPR-Cas9技术,在多发性骨髓瘤细胞中进行了全基因组筛选,寻找能够进一步提高免疫调控类药物疗效的潜在靶点。该文章使用的GeCKOv2文库能针对细胞内的19050条基因(每条基因被6条sgRNA所靶向)和1864条微RNA(每条微RNA被4条sgRNA所靶向),这能确保筛选的覆盖率。通过如下筛选流程:CRISPR-Cas9文库扩增--感染MM1S细胞--使用泊马度胺进行药物筛选--收取药物筛选7d,14d,21d的实验组及对照组细胞进行高通量测序。发现多发性骨髓瘤对亚胺类药物产生耐药的机制,并针对多发性骨髓瘤对提出了新的治疗方案,以增强对亚胺类药物的敏感性或克服耐药性。



3.Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in gastrointestinal stromal tumor with Imatinib resistance



图6.jpg






         伊马替尼(格列卫)是一种治疗白血病及胃肠道间质肿瘤的药物,但往往产生耐药,机制不明。在该研究中,研究人员利用CRISPR-Cas9全基因敲除文库技术筛选针对胃间质瘤的伊马替尼耐药的基因。


5. CRISPR/cas9文库应用拓展,与新药筛选,整体课题进行链接

新药筛选:基因与药物

整体课题:肿瘤相关基因经典研究方案


6. 参考文献

1)Chen S, Sanjana NE, Zheng K, et al.Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis.Cell. 2015 Mar 12;160(6):1246-60.

2)Liu J, Song T, Zhou W, et al.A genome-scale CRISPR-Cas9 screening in myeloma cells identifies regulators of immunomodulatory drug sensitivity.Leukemia. 2019 Jan;33(1):171-180.

3)Cao J, Wei J, Yang P, et al.Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in gastrointestinal stromal tumor with Imatinib resistance.Mol Cancer. 2018 Aug 13;17(1):121. 


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