敲低Circ-MBOAT2靶向调控miR-433-3p/GOT1轴抑制胰腺癌的肿瘤进展和谷氨酰胺分解代谢
2021.06.11
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本次向大家推荐一篇来自武汉协和医院副主任医师-彭涛在J Exp Clin Cancer Res杂志投的一篇文章,文章题目“Circ-MBOAT2 knockdown represses tumor progression and glutamine catabolism by miR-433-3p/GOT1 axis in pancreatic cancer”,这是刚刚在该杂志发表的,影响因子:7.068分,内容主要讲的是敲低Circ-MBOAT2靶向调控miR-433-3p/GOT1轴从而抑制胰腺癌的肿瘤进展和谷氨酰胺分解代谢。


研究背景

胰腺癌是一种恶性肿瘤,在所有癌症中的发病率排名第六。据报道,环状RNA(circRNA)调节胰腺癌的进展,在原来的一些基础研究中,作者发现含有2个环膜结合的O-酰基转移酶结构域(circ-MBOAT2)在胰腺癌组织标本和细胞样本中高表达,但是尚不清楚circ-MBOAT2对胰腺癌过程的调节作用。在miRNA的确认中,有相关研究表明miR-433-3p能够抑制肿瘤发生的过程,以至作者选用它作为circ-MBOAT2相互作用的研究对象,通过网站预测发现miR-433-3p和circ-MBOAT2有相互结合的位点;在下游靶基因的选择中,作者选择了癌症细胞增殖所必须的一种物质——谷草转氨酶(GOT1),其在谷氨酸代谢中非必须氨基酸的产生起到至关重要的作用,也有相关研究报道谷草转氨酶对胰腺癌的增殖有着促进的作用。根据这些基础工作,作者提出了在胰腺癌肿瘤进展过程中,circ-MBOAT2通过海绵吸附作用miR-433-3p从而使GOT1表达对肿瘤细胞的增殖有着促进作用。


研究结果

1、Circ-MBOAT2在胰腺癌组织和细胞中高表达

作者通过QPCR的方法检测胰腺癌组织和细胞中几个感兴趣的circRNA,结果发现Circ-MBOAT2在胰腺癌组织以及细胞中高表达(如下图A)。为了判断所发现的Circ-MBOAT2为环状结构,将提取的RNA加入RNase R,接着检测Circ-MBOAT2在样本中的稳定性,结果发现,在样本中Circ-MBOAT2含量并没有减少(如下图C-D),作者接下来为了检测Circ-MBOAT2在细胞中的定位,将样本进行核质分离,分别检测Circ-MBOAT2的含量,结果表明Circ-MBOAT2主要存在于细胞质中(如下图E-F)


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2、敲低Circ-MBOAT2对胰腺癌细胞功能的影响

作者继续探讨Circ-MBOAT2是否调节胰腺癌的形成,通过敲低Circ-MBOAT2(si- Circ-MBOAT2)在PANC-1 and SW1990的表达,观察细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡以及谷氨酸-草酰乙酸转氨酶1(GOT1)、α-酮戊二酸、谷氨酸的mRNA表达水平,这些结果表明了在细胞水平上敲低Circ-MBOAT2的表达,能够抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移以及下游通路中相关基因mRNA水平的降低,从而引起肿瘤细胞的凋亡(如下图A-J)。


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3、敲低Circ-MBOAT2胰腺癌细胞在动物体内的成瘤观察

通过成功构建敲低Circ-MBOAT2稳转细胞株(Sh- Circ-MBOAT2+SW1990),皮下接着裸鼠,结果发现,在相同的成瘤时间,敲低Circ-MBOAT2的细胞株成瘤能力明显降低,运用QPCR技术检测瘤体中Circ-MBOAT2 mRNA表达水平,结果表明敲低Circ-MBOAT2组中Circ-MBOAT2的mRNA表达显著低于Circ-MBOAT2组(如图A-D)。


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4、Circ-MBOAT2海绵吸附miR-433-3p相结合

在双荧光素梅实验中,通过构建包含miR-433-3p潜在结合序列的Circ-MBOAT2重组荧光宿酶报告质粒pGL3-Circ-MBOAT2-WT及包含突变了结合序列的重组质粒pGL3-Circ-MBOAT2-MUT;通过瞬转的方式把重组质粒pGL3-Circ-MBOAT2-WT以及pGL3-Circ-MBOAT2-MUT分别跟miR-433-3p mimic共转到两株人胰腺癌细胞PANC-1 and SW1990中,同时也设了分别跟miR-NC共转到细胞中;结果如图所示,在pGL3-Circ-MBOAT2-WT+miR-433-3p mimic组中,相对荧光素酶活性显著抑制相对于pGL3-Circ-MBOAT2-MUT+miR-433-3p mimic、pGL3-Circ-MBOAT2-WT+miR-NC和pGL3-Circ-MBOAT2-MUT+miR-NC,说明了Circ-MBOAT2和miR-433-3p能够相互结合。


通过实时荧光定量PCR检测34对胰腺癌组织和旁癌组织中miR-433-3p的表达,结果表明在胰腺癌组织中miR-433-3p显著表达(如图E);通过斯皮尔曼相关分析,Circ-MBOAT2和miR-433-3p呈负相关(如图F);在PANC-1和SW1990细胞中,Circ-MBOAT2显著高表达,而miR-433-3p显著低表达(如图G和H);然而在这两株细胞中,通过si- Circ-MBOAT2敲减其在细胞中的表达检测miR-433-3p mRNA表达水平,发现miR-433-3p显著上升(如图I)。


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5、Circ-MBOAT2通过miR-433-3p调节胰腺癌的发展

作者通过上面的实验证实了Circ-MBOAT2能海绵吸附miR-433-3p相结合的作用方式,进一步通过实验设计Circ-MBOAT2是否通过miR-433-3p调节胰腺癌的发展。在PANC-1 和SW1990细胞中,通过合成miR-433-3p inhibitor在细胞中敲低miR-433-3p,QPCR技术检测细胞中miR-433-3p mRNA表达水平,合成的miR-433-3p inhibitor起到一个很好的敲低作用(如下图A);接着作者通过在两株细胞中瞬转si-Circ-MBOAT2-NC、si-Circ-MBOAT2、si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p inhibitor以及si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p inhibitor-NC四组,分别做了细胞增殖实验、平板克隆形成实验、细胞凋亡、侵袭、迁移、检测谷氨酰胺消耗、α-酮戊二酸产生和谷氨酸产生来解释Circ-MBOAT2通过海绵吸附miR-433-3p作用调节胰腺癌的发展以及谷氨酰胺分解代谢,在细胞凋亡实验中,si-Circ-MBOAT2、si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p NC这两组细胞凋亡水平无显著变化,但是相对于si-Circ-MBOAT2-NC和si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p inhibitor这两组,凋亡水平显著上升的趋势(如下图F);剩下的实验结果和细胞凋亡结果相反(如下图C-E、G-K)


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6、胰腺癌细胞中miR-433-3p和GOT1相互结合作用

同样进行双荧光素梅实验,构建miR-433-3p潜在结合下游靶基因GOT1 3’UTR的重组荧光素梅报告质粒pGL3-GOT1 3’UTR-WT和突变了结合序列的重组质粒pGL3-GOT1 3’UTR-MUT。实验结果表明miR-433-3p能和GOT1相结合,在pGL3-GOT1 3’UTR-WT+miR-433-3p mimic组中荧光强度显著降低(如下图A-C)。


同样取34对胰腺癌组织和旁癌组织做QPCR和WB实验检测GOT1表达水平,结果表明在胰腺癌组织中GOT1 mRNA水平以及蛋白水平高表达,说明了GOT1在对胰腺癌的研究中有着重要的作用。在细胞层面上也检测了GOT1的表达水平,相对于HPDE正常胰腺上皮细胞,PANC-1和SW1990两株胰腺癌细胞中的GOT1同样是高表达;miR-433-3p和GOT1的表达水平呈负相关;接着通过在细胞中瞬转miR-433-3p inhibitor和miR-433-3p mimic检测GOT1蛋白表达水平,发现在miR-433-3p inhibitor组中,GOT1蛋白表达水平显著上升。


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7、miR-433-3p作用于下游靶基因GOT1调控胰腺癌进展和谷氨酰胺代谢

作者通过在PANC-1和SW1990细胞中分别瞬转miR-NC、miR-433-3p mimic、miR-433-3p mimic +pcDNA以及miR-433-3p mimic+pcDNA- GOT1四组,后面分别检测细胞增殖、细胞凋亡、侵袭、迁移、检测谷氨酰胺消耗、α-酮戊二酸产生和谷氨酸产生,这些结果表明了,miR-433-3p作用于下游靶基因GOT1从而抑制细胞增殖、迁移、侵袭和谷氨酰胺代谢,从而促进细胞凋亡(如下图A-K)。


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8、Circ-MBOAT2通过miR-433-3p调控GOT1表达

作者从上面一系列的实验证实了Circ-MBOAT2能海绵吸附作用miR-433-3p,而miR-433-3p能够跟下游靶基因GOT1相互作用从而调控胰腺癌的发展,所以作者提出了circMBOAT2是否通过分泌miR-433-3p调控GOT1的表达。结果显示,PANC-1和SW1990细胞中的circ-MBOAT2沉默显著下调了GOT1的mRNA和蛋白质水平;但是miR-433-3p inhibitor能够回挽这种影响(如下图A-B)。


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总结

本研究指出Circ-MBOAT2通过miR-433-3p/GOT1轴调节胰腺癌的肿瘤发展和谷氨酰胺分解代谢。这一发现提示circ-MBOAT2可能是胰腺癌的治疗靶点。


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