对于流行性传染疾病，特别是具有一定潜伏时期的病毒感染，对患病人员的确诊非常重要。无论是2003年的非典还是我们现在正在遭受的新型冠状病毒（2019-nCoV）疫情，如果在感染初期或者轻症时期即可通过检测手段进行确诊，治愈几率及预后情况都会大大提高。

       CRISPR/Cas技术以出众的基因编辑能力闻名于世，但显然这技术应用范围绝不仅限于基因编辑。CRISPR/Cas技术的大牛Jennifer Doudna教授早在2016年就将该技术应用于RNA检测，只是由于灵敏度太低而缺乏应用价值。随后张锋大牛利用Cas13蛋白的天然RNase活性将其改进，使之有了实际应用价值，并将其取名为SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing），并且开发了升级版的SHERLOCK v2。后来Jennifer Doudna的实验室利用Cas12a的非特异性ssDNA降解能力开发出另一种称为DETECTR的方法。 

       01、SHERLOCK的原理

       SHERLOCK的核心是一种叫做Cas13的CRISPR相关蛋白。Cas13包含四个不同的家族成员（Cas13a-d），是一种RNA引导的RNase，靶向RNA的单链区域，在具有特定碱基的靶RNA区域产生多个切割位点。Cas13表现出靶依赖性的混杂RNA酶活性，导致旁观RNA分子的反式切割，这种效应被称为“collateral activity （附带活性）”。研究人员利用这一“脱靶缺陷”，加入一种可淬灭的荧光RNA，当荧光RNA被切开时，会发出荧光信号而显示检测结果。 最近发现其它类型CRISPR-Cas系统的Cas酶也显示collateral activity ，如Cas12的亚家族。 尽管Cas13具有称为原间隔物侧翼位点（PFS）的PAM样序列基序，仅对某些目标位点有活性，但是许多非常活跃的Cas13直系同源物，例如LwaCas13a，不显示PFS。 

       DETECTR技术的原理与SHERLOCK相似。Cas12a（Cpf1）通过crRNA靶向特定的双链DNA，切割目标双链DNA后，会对所有的单链DNA发动任意切割。将ssDNA-荧光淬灭（FQ）报道基团加入反应中，在ssDNA降解时就会产生荧信号。

       02、SHERLOCK的流程

       利用SHERLOCK系统检测样品的流程为：

       ✦ 收集样品，提取样品的DNA或者RNA；

       ✦ 以提取的DNA为模板在42℃下进行等温扩增反应，或者将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板在42℃下进行等温扩增反应；

       ✦ 以等温扩增产物为模板体外转录单链RNA；

       ✦ 转录产物与Cas13和检测探针孵育，检测荧光信号。

       制备SHERLOCK系统需要原核表达和纯化Cas13，设计crRNA并且体外转录，制备带荧光标记的单链RNA探针。

       03、SHERLOCKv2

       与SHERLOCK比较，SHERLOCKv2具有有4个方面的改进： 

       ✦ 4通道单反应多重分析，1个反应可以检测4种核酸，使用了1个Cas13a、两个不同菌株的Cas13b和1个Cas12a ，每个酶的crRNA不同，激活后能切割的核苷酸序列也不相同；

       ✦ 可以定量测量低至2 attomolar（ 10-18摩尔  ）的底物；

       ✦ 通过将Cas13与Csm6（一种与CRISPR相关的辅助酶）结合，使信号灵敏度提高3.5倍；

       ✦ 切割后的报告基团可通过试纸条来检测，不用依赖荧光。

       04、SHERLOCK的优势

       与常用的诊断技术ELISA（酶联免疫吸附剂测定）、荧光RT-PCR（实时荧光反转录聚合酶链式反应）等比较，SHERLOCK的优势包括：

       ➀ 检测范围广，SHERLOCK使用的LwaCas13a没有PAM，因此可以检测任何核酸序列；

       ➁ 灵敏度高，可以定量测量低至2 attomolar（ 10-18摩尔）的底物；

       ➂ 使用方便，用试纸条检测不需要特殊的设备；

       ➃ 成本低，每次测试仅需要0.61美元（约为4.2元人民币）。

       05、SHERLOCK的应用

       SHERLOCK可以用于检测寨卡病毒、登革热病毒的特定株系，检测大肠杆菌和绿脓杆菌的基因组，对人类DNA进行基因分型，鉴定游离DNA中的低频率癌症突变（Gootenberg et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017, 356(6336):438-442）；检测大豆的草甘膦抗性基因（Abudayyeh et al. Nucleic Acid Detection of Plant Genes Using CRISPR-Cas13. CRISPR J.  2019, 2:165-171）。基因编辑大牛张锋已利用SHERLOCK系统检测冠状病毒2019-nCoV。