本期向大家介绍一篇发表在The Journal of Clinical Investigation的一篇关于FOXA1过表达抑制癌症中的干扰素信号和免疫反应的文章，文章题目为：FOXA1 overexpression suppresses interferon signaling and immune response in cancer。DOI：10.1172/JCI147025，影响因子：14.801。

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34101624/

转录因子FOXA1是前列腺癌（PCa）和管腔乳腺癌（BCa）细胞中雄激素受体（AR）和雌激素（ER）受体活性所必需的先峰因子。FOXA1基因也与这两种癌症有关，因为它经常发生突变。FOXA1的体细胞点突变频率约为4%至8%，并且FOXA1突变通过重新编程这些癌症类型中AR和其他因子的功能来促进癌症进展。在目前的研究中，我们确定了FOXA1在抑制IFN信号和癌症免疫反应中的作用，这驱动了癌症免疫逃避和治疗抗性。

一、研究结果

1、FOXA1在PCa和BCa中与IFN信号活性呈负相关。

研究者通过对TCGA 中PCa和BCa的RNA测序(RNA-seq)数据集进行了荟萃分析，以寻找与IFN活性负相关的基因。基因集富集分析(GSEA)揭示了TCGA中PCa和BCa患者队列中FOXA1和IFN反应基因表达之间的负相关关系(图1A)。为了证实荟萃分析数据，在PCa患者样本中进行了单细胞RNA-seq (scRNA-seq)，并证明FOXA1水平与管腔细胞群中IFN应答信号基因和APM基因的表达呈负相关(图1B)。对来自两组BCa患者标本的scRNA-seq数据进行荟萃分析，从BCa细胞获得了类似的结果(图1C)。

2、FOXA1结合STAT2 DNA结合域，抑制STAT2的DNA结合能力。

免疫荧光细胞化学分析结果显示IFN-α处理增加了IFN信号传导主要效应物STAT1和STAT2蛋白在细胞核中的定位，在细胞核中它们与FOXA1共定位(图2A)。Co-IP分析显示FOXA1在用IFN-α处理的LNCaP和MCF7细胞的细胞核中以内源性水平与STAT1和STAT2相互作用（图2，B和C)。GST pulldown实验显示FOXA1-M (aa 247–294)的C-末端部分（FOXA1的STAT2结合区SBR）的缺失消除了FOXA1与STAT2的DNA结合域（DBD）的相互作用(图2，D和E)， FOXA1的两个缺乏DNA结合的突变体仍然能够结合STAT2 DBD并抑制IFN活性(图2，F和G)，这表明FOXA1独立于其DNA结合功能抑制IFN信号传导。

3、FOXA1抑制IFN-α诱导的STAT2染色质占位，其作用与肿瘤中其突变无关。

LNCaP和MCF7细胞株的ChIP-qPCR验证了IFNα刺激和FOXA1-KD增强了STAT2与在染色质上与典型的IFN信号基因位点如ISG15、IFI44、HLA-E和PSMB9的结合 (图3D)。WT-FOXA1 和 DNA 结合缺陷突变体FOXA1ΔαH3 而非STAT2 结合缺陷突变体 FOXA1ΔSBR 的恢复表达逆转了 FOXA1-KD 增强的 STAT2 在靶位点的结合（图 3D），说明FOXA1以依赖于STAT2的FOXA1结合的方式抑制STAT2染色质结合和IFN信号传导，但是这种作用不需要FOXA1的DNA结合活性。

4、通过转录组分析鉴定受FOXA1影响的STAT2靶基因。

研究者对STAT2 ChIP-seq和RNA-seq数据进行了整合分析，确定了62个FOXA1抑制的STAT2靶基因(图4A)。GO-BP分析显示，这组基因与干扰素或免疫反应密切相关(图4B)。重要的是，研究者发现 FOXA1-KD在用IFN-α处理的LNCaP细胞中诱导这组基因的上调；然而，STAT2 co-KD逆转了这种效应(图4)。通过进行RT-qPCR分析显示FOXA1过表达降低了FOXA1-negative DU145细胞中STAT2靶基因子集的表达，并且在IFN-α刺激下，FOXA1-high LNCaP细胞中的FOXA1-KD增加了该基因子集的表达(图4，D和E)。这些结果表明，FOXA1抑制一组IFN-α刺激的STAT2靶基因的表达，这些基因与IFN信号和免疫反应高度相关。

5、FOXA1过表达抑制小鼠和患者的抗癌免疫反应。

构建小鼠PCa模型，Poly(I:C)给药降低了大多数缺乏内源性Foxa1表达（TRAMP）小鼠的对照肿瘤的生长，延长了小鼠的总体生存期(图5,A和B)。相比之下，poly(I:C)在过表达WT-FOXA1和FOXA1ΔαH3的肿瘤中生长抑制作用大大减弱，但FOXA1ΔSBR没有(图5,A和B)。此外，在使用poly(I:C)处理的对照肿瘤中，TILs，特别是CD8+ T细胞(包括细胞毒性[GZMB+] CD8+ T细胞)明显增加。研究者对先前报告的数据的荟萃分析显示，与敏感肿瘤相比，耐药肿瘤中FOXA1 mRNA水平高得多，而效应T (Teff)细胞标记基因的表达和IFN活性与鼠乳腺肿瘤对抗-PD-1和抗-CTLA4联合治疗的反应呈正相关(图5C)。

使用多西环素诱导的shRNAs有效地敲除了小鼠MyC-CaP PCa细胞系中的内源性FOXA1，并证明FOXA1-KD在IFN-α处理后增强了MyC-CaP细胞中的IFN信号(图6A)。使用这些稳定的MyC-CaP细胞系建立了PCa小鼠模型，并用抗PD-1和抗CTLA4抗体联合或不联合多西环素治疗小鼠。证明了多西环素处理的FOXA1-KD增强了MyC-CaP肿瘤中抗-PD-1和抗-CTLA4的治疗效果(图6，B–E)。FFOXA- KD还增加了MyC-CaP肿瘤中IFN反应基因的表达和细胞毒性CD8+细胞的积累(图6，F和G)。这些数据不仅表明FOXA1介导对ICI免疫疗法的抗性，而且暗示FOXA1是使PCa对ICI敏感的可行靶点。

为了探索FOXA1是否与新辅助化疗(NAC)相关的免疫反应相关，研究者对126例BCa患者的RNA-seq数据分析，与有病理完全缓解（pCR）的肿瘤相比，无pCR的肿瘤中FOXA1的基因水平明显更高，而IFN的活性则相反(图7A)。与pCR肿瘤相比，无pCR肿瘤表达的Teff细胞标记基因表达水平低得多，而FOXA1的表达水平高得多(图7A)，支持FOXA1在BCa患者中负调节IFN信号和免疫反应的作用。在3个独立的BCa队列中也观察到高FOXA1表达与低IFN活性和NAC抗性的关联(图7，B–D)。

研究者还评估了膀胱癌中FOXA1与IFN激活和ICI免疫治疗反应的关系。类似于PCa和BCa的结果，FOXA1的表达与IFN应答信号和APM基因的水平呈负相关，但与TMB无关(图8，B和C)。此外，使用免疫组织化学(IHC)检测了22例膀胱、输尿管和肾盂尿路上皮癌患者在抗PD-1治疗前的FOXA1蛋白表达。研究发现，表达较高FOXA1蛋白水平的肿瘤患者无进展生存率低得多(图8D)。

总之，来自PCa、BCa和膀胱癌患者的数据表明，FOXA1的过度表达有助于临床上的免疫逃避以及免疫和化疗耐药性。

二、小 结

FOXA1过表达介导的STAT2 DNA结合和IFN信号基因表达抑制是不同癌症类型(包括PCa、BCa和膀胱癌)免疫逃避的机制。FOXA1的这种作用既不依赖于它的先锋因子功能，也不依赖于它在癌症中检测到的突变。