环状RNA(circRHOBTB3)通过调节HuR介导的PTBP1稳定性抑制结直肠癌转移
2022.01.12
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本期为大家介绍的是一篇今年6月份在Theranostics杂志上发表的一篇文章,影响因子8.577分,文章作者是来自中国浙江大学邵逸夫医院的徐建斌和宋章法,题目是:环状RNA(circRHOBTB3)通过调节HuR介导的PTBP1稳定性抑制结直肠癌转移。

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34158864


一、研究背景

结直肠癌(CRC)是第三种最常见的癌症,也是跟癌症相关死亡的主要原因。遗传和表观遗传水平的改变普遍被认为是大肠癌发生和发展的主要因素。基因遗传改变主要体现在染色体不稳定、微卫星不稳定以及一些关键驱动基因的改变;表观遗传的改变主要指CpG岛甲基化表型。随着早期筛查和基因组图谱检测体细胞变异的实施,越来越多的结肠癌患者实现了早期诊断和有针对性的治疗。但是,目前大多数结肠癌患者死于晚期疾病或者复发,主要原因是肿瘤发生了转移。因此,迫切需要更好地了解结肠癌转移的驱动因素和分子机制,以制定更好的治疗策略。

目前通过高通量测序以及生物信息学算法发现在不同的癌症中有越来越多的功能性CircRNA,但是对结肠癌转移的影响和潜在机制仍不清楚。


二、研究方法

通过RNA-seq和QPCR筛选CRC组织和邻近正常组织之间差异表达的circRNA。CCK-8、细胞迁移和划痕愈合试验以确定circRHOBTB3在细胞增殖和转移中的功能。RNA-pulldown 和RNA免疫沉淀试验验证 circRHOBTB3 和 HuR(ELAVL1)蛋白之间的相互作用。进一步的 RNA-seq 和功能救援实验寻找下游目标基因。最后进行了裸鼠异种移植模型,以阐明 circRHOBTB3 对体内癌症转移的影响。


三、研究结果

1  circRHOBTB3在结直肠癌组织中低表达

作者通过选取3对结肠癌患者的癌组织和旁癌正常组织进行高通量测序,结果发现,496个CircRNA分子有显著变化,其中403个环状RNA分子的表达量显著降低,93个环状RNA分子的表达量显著升高。然后选取TOP 前10的环状RNA分子进行后续的癌组织样本QPCR验证,表明9个CircRNAs具有统计学差异,其中circRHOBTB3的P值最小,丰富度较高。最后作者通过对肿瘤组织分离原代细胞(肿瘤细胞以及基质细胞),结果发现circRHOBTB3在基质细胞中的表达没有明显变化。


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2  CRC患者中circRHOBTB3的表达及特征

作者通过对83例不同临床分期的大肠癌组织样本circRHOBTB3的表达观察,结果发现晚期患者临床样本组织circRHOBTB3的表达量相对于早期显著降低。circRHOBTB3由Alu基因的外显子6和7的反向剪接形成。通过向外发散引物和向内收敛引物以及Sanger测序验证了circRHOBTB3的反向剪接位点,同时也表明了在cDNA中能检测到circRHOBTB3,而在gDNA中检测不到circRHOBTB3。另外,circRHOBTB3耐RNase R。最后通过定量circRHOBTB3在细胞质和细胞核中的水平来检查其定位,FISH结果表明circRHOBTB3在细胞核和细胞质中都有所分布。


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3  circRHOBTB3抑制CRC细胞的转移

通过QPCR的方法检测circRHOBTB3在正常结肠上皮细胞和不同结肠癌细胞,结果表明circRHOBTB3的表达量在正常细胞中显著高于癌细胞。在HCT116和Colo320这两株细胞中过表达circRHOBTB3,结果表明侵袭和迁移能力明显减弱,同时在DLD-1和SW480这两株细胞中敲低circRHOBTB3,结果表明侵袭和迁移能力明显增强。由于发现了circRHOBTB3可能跟细胞的转移有关,作者通过WB检测EMT相关蛋白分子,结果说明过表达circRHOBTB3对结肠癌细胞的转移有一定的抑制作用。


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4  circRHOBTB3和HUR结合并对HUR降解作用

作者为了探讨circRHOBTB3在大肠癌转移中的调控机制,通过4个在线网站分析能和circRHOBTB3结合的分子,结果筛选出三个蛋白分子(SRSF1,FUS和HuR)。接下来通过RNA-pulldown和RIP验证circRHOBTB3分子分别和SRSF1,FUS and HuR的结合关系,结果表明circRHOBTB3和HuR相互结合的关系。通过观察过表达或者敲低circRHOBTB3后HuR的表达量,QPCR和WB结果表明,在过表达circRHOBTB3的菌株中,HuR的蛋白表达量显著降低,反之则相反,而HuR mRNA表达水平并没有影响。因此作者假设circRHOBTB3可能在转录后调节HuR蛋白的稳定性,作者通过实验设计发现circRHOBTB3能够通过对β-Trcp1调节作用起到对HuR蛋白有效的降解。


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5  circRHOBTB3降解HUR以降低下游靶基因PTBP1的表达水平

作者通过构建过表达circRHOBTB3稳转细胞株,进行高通量测序(RNA-seq),通过分析选取PTBP1作为后续的研究基因,接着作者通过QPCR和WB实验证明PTBP1的表达水平受到circRHOBTB3和HUR的相互作用。


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6  circRHOBTB3抑制PTBP1表达水平调节细胞转移作用

通过侵袭、迁移实验以及WB结果表明,过表达PTBP1能够部分逆转circRHOBTB3对细胞迁移和侵袭的抑制作用。


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7  动物实验

作者为了研究circRHOBTB3在体内控制大肠癌转移的作用,通过构建过表达circRHOBTB3或同时过表达circRHOBTB3和PTBP1的稳转细胞株,将细胞通过裸鼠尾静脉植入肺腔。活体成像结果显示过表达circRHOBTB3组荧光素酶活性显著降低,HE染色结果表明过表达circRHOBTB3组肿瘤形成显著减少。然后在同时过表达circRHOBTB3和PTBP1组在一定程度逆转了这种现象。该部分结果说明了circRHOBTB3在体内抑制肿瘤转移。取材病灶部分组织做WB和IHC实验,分别检测HUR、PTBP1和EMT相关蛋白分子,circRHOBTB3组表达降低,跟体外细胞结果相一致。


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四、结 论

研究结果表明,circRHOBTB3 通过 HuR/PTBP1 轴对 CRC 侵袭性产生抑制作用。


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