J Clin Invest:唐氏综合征患者iPSC来源类脑器官中,抑制DSCAM/PAK1逆转神经发生缺陷
2021.06.15
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唐氏综合征(DS)是由于第21号染色体数目或结构异常,引起的以生长发育迟缓、畸形的先天性疾病,常见的为多了一条21号染色体,发病率在新生儿中约1/800。南京医科大学的研究人员近期在J Clin Invest(影响因子11.864)发表文章,报道了皮层下神经元增殖减弱和第Ⅱ、Ⅳ层标志物表达下调,从而影响神经发生,这可能是类器官体积减少的原因;抑制DSCAM/PAK1逆转异常的神经发生,增加DS iPSCs来源类器官体积大小。


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结果展示


1、单细胞测序显示,21三体类器官神经发育改变


研究者分别获得来自3名DS患者的3个iPSC类器官、3个整倍体iPSC类器官和1个hESC来源类器官。组织学分析表明,类似整倍体类器官,21三体类器官显示区域化富集和皮质层;scRNA-seq结果表明,无偏聚类识别了8种主要的细胞类型;scRNA-seq转录组数据与Allen Brain Atlas的3D原位杂交数据比对,类脑器官细胞簇高度匹配到胎龄(E)13.5的鼠脑部背侧端脑;scRNA-seq转录组数据与BrainSpan比对,类器官pcw8和pcw9时与死后胎儿组织呈显著正相关;21三体类器官在第30天观察到前体细胞到神经元的发展轨迹呈延迟状态;GO分析,显著富集到神经发生,前脑发育和神经前体细胞增殖。信号通路富集分析神经发生相关的通路被显著改变。


综上所述,与整倍体类器官相比,DS类脑器官的神经发育被显著改变。


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图 1. 类脑的Single-cell transcriptional 表达谱


2、染色质可接近性破坏导致三体iPSCs衍生的类脑转录受损


ATAC-seq结果表明,DS的21号染色体启动子区域,染色质可接近性显著而广泛地增加,与整倍体iPSCs衍生的类脑相比,三体iPSCs衍生的类脑中鉴别出差异开放染色质区域(dOCRs)上调的有1785个,下调的有1695个,dOCRs被富集在神经发生和神经系统发育。 


Bulk RNA-seq 分析D30的2组类脑,差异表达基因中,104个基因上调,91个基因下调,与scRNA-seq数据结果一致,差异表达基因显著富集在神经系统发育,细胞增殖,神经发生。共同上调和下调的基因被富集的生物进程有中枢神经系统神经元分化、神经元迁移和谷氨酸受体信号通路。


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图 2. 转录组和ATAC-seq 分析类脑


3、神经前体细胞(NPCs)增殖减少导致DA衍生的皮质类器官变小


与7天整倍体胚体相比,三体胚体周长缩短;21三体类器官的大小明显小于整倍体类器官,类器官的扩张速度明显减慢;研究者评估了神经上皮环路结构(顶膜和基膜的长度,环的直径,脑室样区域的大小,总环面积,环组织面积),21三体类器官所有参数均减小,该结果与临床观察到的DS患者脑体积减小一致。


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图 3. DS患者来源类脑体积大小和扩张速率减小


研究者发现,在三体皮层VZ样区域 NPCs相关指标(PAX6)、增殖指标(Ki67、EdU)和SOX2表达量显著下调。结果提示,三体NPCs增殖下降是21三体类器官体积较小的主要原因。


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图 4. D30类脑增殖研究


研究者进一步评估皮层神经元不同亚型的生成,CTIP2表达量在DS组显著下调, TBR1无明显差异;为了进一步研究DS的后期的发展阶段,作者完成了D70类脑的scRNA-seq和组织学分析,21三体类脑中皮层深层和上层成熟神经元组成明显减少;在三体谷氨酸能神经元中,表达皮层上层标记物的细胞比例(BRN2 , SATB2)减少。

 

因此,21三体类脑增殖减弱可能导致神经发生减少。


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图 5. 类脑的神经发生研究


4、敲除DSCAM逆转DS类脑的增殖缺陷

前期研究表明DSCAM在21三体细胞、DS患者尸检组织和DS动物模型中高表达。DSCAM的ocr在21三体类器官中显示启动子染色质开放程度显著增加;PAK1作为DSCAM下游,调控神经前体细胞增殖和突触可塑性;在21三体类脑中,DSCAM、PAK1的蛋白和mRNA表达量显著高于对照组。


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图6. DS来源的皮质培养模型中,DSCAM-KD 挽救受损的 DSCAM-PAK1 信号


研究者利用CRISPR/Cas9敲除DSCAM或CRISPR干扰DSCAM,构建 DSCAM-KD iPSCs或CRISPRi-based DSCAM-KD ,随后衍化为类脑。核型分析显示DSCAM-KD iPSCs来源类脑HSA21 三体;通过调控DSCAM表达,21三体类脑增殖和神经发生缺陷被恢复。


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图7. DS来源的皮质培养模型中,敲除DSCAM恢复异常的神经发生


5、FRAX486挽救了DS类器官的异常增殖和神经发生

研究者用一种调节PAK1磷酸化的抑制剂 FRAX486处理DS1类脑, 降低了p-PAK1蛋白水平;在神经上皮环的异常结构的部分救援;FRAX486在分化30天后,能有效促进NPCs增殖;通过FRAX486处理抑制PAK1,随后增加了CTIP2和SATB2的表达,提示挽救了神经发生。


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图 8. DS类脑中下调PAK1挽救 增殖和神经发生缺陷



小结


类脑器官模型为研究DS早期发育缺陷提供了新的途径,目前的分析为确定DS的治疗靶点和筛选药物提供了候选者。


参考文献:Tang XY, Xu L, Wang J, Hong Y, Wang Y, Zhu Q, Wang D, Zhang XY, Liu CY, Fang KH, Han X, Wang S, Wang X, Xu M, Bhattacharyya A, Guo X, Lin M, Liu Y. Suppressing the DSCAM/PAK1 pathway reverses neurogenesis deficits in Down Syndrome patient iPSC-derived cerebral organoids. J Clin Invest. 2021 May 4:135763. 


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