ALKBH5通过m6A-dependent表观遗传沉默pre-miR-181b-1/YAP信号轴抑制骨肉瘤的进展
2021.02.04
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前言

骨肉瘤是最常见的原发性骨实性恶性肿瘤之一,好发于青少年和年轻人。患者的标准治疗包括化疗和手术。随着各种先进治疗方法的发展,患者的存活率大大提高了。然而,目前还没有已知的预防方法。因此,深入了解其发生机制,开发新的骨肉瘤治疗药物迫在眉睫。

N6-methyladenosine (m6A) 是真核生物mRNA中最丰富的可逆甲基化修饰。近年来,许多研究集中在m6a修饰的mRNA的生物学功能上。m6A修饰被发现参与多种生物学过程,并在癌症进展中发挥重要作用。如,FTO在急性髓系白血病(AML)中起着致癌因子的作用。ALKBH5已被证明与胰腺癌、胶质母细胞瘤有关,并影响雄性小鼠的生育能力。然而,对于m6A修饰在人骨肉瘤中的功能和潜在机制仍有很大程度的未知。



研究结果

1. m6A去甲基化酶ALKBH5在人骨肉瘤中下调

作者首先采用m6A ELISA和免疫荧光(IF)法定量人骨肉瘤细胞系U2OS、Saos2、143B和人成骨细胞(hOB) hFOB1.19细胞系中m6A的含量。结果显示,骨肉瘤细胞中m6A含量显著升高。此外,与hOB细胞相比,所有三种骨肉瘤细胞系中去甲基化酶ALKBH5 mRNA与m6A含量呈负相关显著降低,但在METTL3、METTL14、WTAP和FTO中无此现象。同时,免疫染色证实,与hOB细胞相比,U2OS、Saos2、143B骨肉瘤细胞系中的ALKBH5显著降低。此外,在人骨肉瘤组织中检测到ALKBH5的蛋白表达低于正常骨组织。我们进一步应用免疫组化(IHC)检测含102个组织芯的骨肉瘤组织微阵列(TMAs)中ALKBH5蛋白的表达。与正常骨组织相比,在恶性骨肉瘤核心部位,特别是IVB期(最高程度的骨肉瘤)检测到ALKBH5蛋白表达显著降低。来自TCGA数据集的Kaplan-Meier生存分析显示ALKBH5高表达的患者存活率较高,而低ALKBH5表达的患者存活率较低。以上结果表明,在人骨肉瘤中ALKBH5普遍下调,可能介导m6A修饰,在人骨肉瘤中发挥重要作用。


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Fig.1在人骨肉瘤中m6A修饰水平上升伴随着去甲基化酶ALKBH5表达的降低



2. ALKBH5-依赖的 m6A去甲基化严重影响骨肉瘤细胞的生长和运动

为了确定ALKBH5调控m6A修饰是否在骨肉瘤细胞中起作用,作者分别过表达、敲降ALKBH5的表达来验证其细胞功能。我们检测了ALKBH5对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。与预期一致,过表达ALKBH5显著抑制U2OS细胞的增殖、侵袭和迁移能力,而抑制ALKBH5的表达则诱导相反的作用。此外,当ALKBH5过表达时,早期和晚期凋亡细胞百分比均显著增加,而ALKBH5敲低对细胞的凋亡影响甚微。细胞克隆实验也产生类似的结果。


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Fig.2 ALKBH5对人骨肉瘤细胞的抑瘤作用



3. 鉴定ALKBH5 / m6a - pre - miR - 181 - b - 1 / miR -181b-5p-YAP轴作为一种新的通路抑制骨肉瘤肿瘤的进展

(1)ALKBH5通过调控pre-miR-181b-1的表达水平抑制骨肉瘤细胞增殖

如上所示,作者已经证明了ALKBH5依赖的m6A rna去甲基化对骨肉瘤肿瘤抑制的重要性。接下来,进一步深入了解其具体的分子机制。MiRNA的加工过程也受到骨肉瘤的特异性调控。然而,尚无报道显示m6A修饰在骨肉瘤miRNA加工过程中的生物学功能。因此,作者使用m6A 芯片在对照和过表达ALKBH5的U2OS细胞中鉴定ALKBH5修饰的miRNAs前体。通过微阵列检测到773个pre- miRNA,鉴定出11个在ALKBH5过表达的细胞中,比对照细胞减少20%(>减少1.2倍)的pre- miRNA。值得注意的是,在pre- mirna中,pre-miR-181b-1再过表达ALKBH5后,甲基化显著降低。更重要的是,pre-miR-181b-1序列在不同物种间广泛保守。这些发现表明在骨肉瘤中pre-miR-181b-1是ALKBH5的一个潜在的作用靶点。进一步发现,premiR-181b-1在m6A-RIP中富集,而在IgG-IP中不富集。此外,pre-miR-181b-1和成熟miR-181b-5p在骨肉瘤细胞中明显低于hOB细胞。过表达ALKBH5可显著增加U2OS细胞中premiR-181b-1和miR-181b-5p的表达水平。相反,抑制ALKBH5产生相反的效果。正如作者所猜想,miR-181b-5p导致细胞迁移和细胞增殖的减少。miR-181b-5p下调(AMO-181b-5p)部分挽救了U2OS细胞中ALKBH5过表达导致的细胞迁移和增殖下降。


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Fig.3 ALKBH5削弱pre-miR-181b-1的mA6甲基化修饰水平并提高pre-miR-181b-1和miR-181-5p的表达水平



(2)YAP是人骨肉瘤细胞中miR-181-5p的关键靶基因

然后通过计算预测寻找miR-181-5p候选靶基因。通过这种方式,作者发现Yesassociated protein 1 (YAP)是miR-181-5p潜在的靶基因。有报道称YAP是一种致癌基因,在多种肿瘤发生发展中具有重要作用。接下来,作者证实了过表达的miR-181b-5p确实直接抑制了其靶基因YAP在骨肉瘤细胞中的表达,且发现过表达ALKBH5明显抑制了U2OS细胞中YAP的mRNA和蛋白水平,而抑制ALKBH5则使YAP的表达升高。同时,作者证实了YAP对骨肉瘤细胞生长的影响。siRNA沉默YAP显著抑制了U2OS细胞的增殖、侵袭、迁移和集落形成能力。


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Fig. 4 YAP是人骨肉瘤细胞中miR-181-5p的关键靶基因



(3)YAP消除了ALKBH5对骨肉瘤细胞活力和小鼠异种肿瘤生长的抑制作用

为探究ALKBH5与YAP的相互关系,作者进一步分析了细胞生长的影响。与单独过表达ALKBH5相比,ALKBH5与YAP共表达组的细胞增殖明显增加。YAP还抵消了ALKBH5对U2OS细胞侵袭和迁移的抑制作用,YAP显著提高了活细胞百分率,减少了凋亡细胞,恢复了集落形成能力。并且,作者利用异种骨肉瘤小鼠模型评估了ALKBH5介导的m6A去甲基化的体内有效性。肿瘤体积和重量的降低,证明了ALKBH5过表达降低了骨肉瘤肿瘤的生长,而这一效果通过共转染过表达的YAP而抵消。


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4)m6A读取蛋白YTHDF2正调节pre-miR-181b-1的稳定

因为ALKBH5介导的m6A去甲基化似乎增加了pre-miR-181b-1的表达,猜想pre-miR-181b-1是YTHDF2(促进m6A甲基化RNA降解的m6A读取蛋白)的一个靶点,与作者的猜想一致,再YTHDF2-IP组分中观察到pre-miR-181b-1的强烈富集。进一步,在U2OS细胞使用siYTHDF2敲降其表达后,pre-miR-181b-1和miR-181b-5p的表达均增加。此外,siYTHDF2可进一步增强ALKBH5过表达的抑瘤作用。以上数据表明ALKBH5介导的pre-miR-181b-1 m6A去甲基化在骨肉瘤中起关键作用。


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Fig. 6 m6A读取蛋白YTHDF2正调节pre-miR-181b-1的稳定



4. 鉴定YAP mRNA作为ALKBH5在骨肉瘤中的直接靶点

(1)ALKBH5直接调控YAP的mRNA和蛋白稳定性

有趣的是,根据基于序列的m6A修饰位点预测网站(http://www.cuilab.cn/ SRAMP),作者观察到YAP基因的mRNA携带9个潜在的m6A修饰位点。接下来作者验证了ALKBH5是否可以直接调控YAP的m6A甲基化和基因降解。采用基因特异性m6A-qPCR检测YAP的表达。过表达ALKBH5后,m6A- RIP组YAP mRNA中m6A丰度明显降低,IgG-RIP组未见明显变化。此外,与siNC组相比,siALKBH5在转录抑制剂actinomycin D (ActD)存在的情况下增强了U2OS细胞中YAP mRNA的稳定性。同时,siALKBH5在翻译抑制剂环己酰亚胺(CHX)的作用下抑制了YAP的降解。然而,过表达ALKBH5产生相反的作用,导致骨肉瘤细胞中YAP-mRNA稳定性显著下降,YAP蛋白降解增加。


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Fig. 7 ALKBH5直接调控YAP的mRNA和蛋白稳定性


(2)m6A-依赖的YAP的翻译增强与YTHDF1呈正相关

以上结果表明,ALKBH5介导的m6A去甲基化抑制了YAP的表达,我们推测甲基化的YAP转录本是YTHDF1(促进甲基化转录本翻译的m6A读取蛋白)的潜在靶点。与IgG-RIP组相比,YTHDF1组YAP mRNA中的丰度明显增加,说明YTHDF1能够识别YAP mRNA中的m6修饰位点。接下来,作者发现YTHDF1 siRNA (siYTHDF1)降低了YAP蛋白水平。且在ALKBH5过表达的U2OS细胞中,过表达YTHDF1导致YAP增加。此外,与预期一致,上调YTHDF1水平可部分恢复对U2OS细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡和集落形成能力的抑制作用。


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Fig. 8 m6A-依赖的YAP的翻译增强与YTHDF1呈正相关


总结

总的来说,作者的结果首次表明ALKBH5是一种抗肿瘤或促凋亡因子,至少部分地通过直接m6A甲基化YAP及甲基化pre-miR-181b-1间接下调YAP水平的双机制抑制YAP的表达来发挥作用。同时,作者也证明了pre-miRNAs可以被ALKBH5甲基化调控其成熟加工的过程。


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