IF：8.4

研究思路：靶点结构分析，数据库虚拟筛选，激酶活性实验，细胞实验、化合物结构优化、体外实验验证，体内实验，分子水平作用机制，药物作用模式分析，作用机制实验。

一、背景

       再生肝磷酸酶(PRL)癌蛋白是在多种肿瘤组织中过度表达的磷酸酶。PRL水平升高与肿瘤的转移和不良的临床结果有关。理论上，PRL磷酸酶可以提供有效的治疗靶点，但由于缺乏特异性靶向它的化合物，PRL磷酸酶在肿瘤治疗上仍然没有得到足够的利用。

二、目的

        PRL磷酸酶是通过三聚体来发挥利用，利用这种独特的性质，借助虚拟筛选和药物化学的方法，寻找能够破坏这种三聚体结构的化合物，从而抑制PRL磷酸酶的活性。通过体外和体内实验，验证化合物的抗肿瘤效果。

三、方法

      虚拟筛选：从ZINC database中，筛选能与PRL1单体间界面结合的化合物。分两步对接，刚性对接（DOCK6.2），柔性对接（图1A、B）。

图1 PRL1三聚体结构（A）及虚拟筛选流程（B）

激酶活性实验：体内、体外。

细胞实验：划痕实验、细胞迁移实验。

化合物结构优化：细胞迁移实验验证。

体外实验验证：构建表达 PRL磷酸酶的细胞和表达三聚体缺陷PRL磷酸酶的细胞。细胞迁移实验验证。

体内实验验证：小鼠实验，表达PRL磷酸酶的小鼠和PRL磷酸酶缺失小鼠的胚胎成纤维细胞。

分子水平作用机制：PRL 1通过激活ERK 1/2和AKT途径促进细胞增殖和迁移，探究化合物对ERK 1/2和AKT途径的影响。

药物作用模式分析：验证化合物作用于PRL的三聚体界面。

作用机制实验：黑色素瘤TCGA表达数据验证PRL 1的促癌作用，体外和体内实验验证化合物的抑癌机制。

四、研究成果

经两步虚拟筛选后，得到56 hits，体外和体内激酶实验，筛选到3个化合物（图2C）能够显著降低细胞内PRL1三聚体的形成，其中Cmpd-43最显著（图2D）。Cmpd-43对细胞的侵袭和迁移也有一定的抑制作用（E、F）

图2 3 hits（C）、体内激酶试验（D）细胞实验（E、F） 

  对Cmpd-43结构进行优化，得到7个类似物（图3A），细胞的迁移实验表明，类似物 -3显示出与CMPD-43相似的效果，而类似物2和4-7似乎比CMPD-43略小。但是类似物-1对细胞增殖或迁移没有影响，这表明在类似物-1中缺失的亚氨基甲基芳族部分对PRL1三聚体抑制活性是关键的（图3B）。

图3 Cmpd-43及其类似物对细胞增殖或迁移的影响

 表达 PRL磷酸酶的细胞促进了细胞的增殖和迁移，而表达三聚体缺陷PRL磷酸酶的细胞增殖和迁移能力和对照细胞相似，说明PRL磷酸酶的三聚体结构在促进细胞增殖和迁移中扮演重要的角色（图4 A、B）。用Cmpd-43和类似物-1处理表达 PRL磷酸酶的细胞和表达三聚体缺陷PRL磷酸酶的细胞。Cmpd-43能抑制表达 PRL磷酸酶的细胞，其余的处理组均没有抑制效果（图4 C）。小鼠实验也证明，Cmpd-43能抑制表达 PRL磷酸酶的细胞，而对PRL磷酸酶缺失的细胞无影响（图4 D）。WB实验验证，CMP D-43(5 mmol/l)能特异性抑制Prl 1介导的HEK 293细胞ERK 1/2和AKT通路的活化。

图4 Cmpd-43及类似物-1对表达PRL磷酸酶/PRL磷酸酶缺陷细胞的影响

 为了验证Cmpd-43是作用于PCL的三聚体界面，从而发挥抑制作用，我们将类似物-3和Cmpd-43分别与PRL磷酸酶共结晶，得到了类似物-3结合的PRL1的共晶体，通过结合模式的分析，发现类似物-3确实是与PCL的BC界面结合，并且与周围的氨基酸残基作用形成了稳定的构象（图5 ABC）。类似物-3与 Tyr14 and Phe132具有较强疏水性接触，而对二聚体界面结合表面的分析表明，这两种残基对三聚体形成的贡献十分有限，因此推测，这两个残基突变会影响类似物-3与PCL的结合，但是不会影响PCL的三聚体结构。我们对Tyr14 and Phe132进行了Ala替换。 结果发现，用Ala取代bar 14和ph 132对PCL三聚和PCL介导的细胞迁移没有影响（图5 DE），并且突变体对Cmpd-43呈现出抗性。这些结果表明类似物-3和Cmpd-43是结合在PRL三聚体界面并防止PRL三聚反应。

图5 类似物-3和Cmpd-43结合到PRL磷酸酶三聚体界面并阻止PRL三聚结构形成

黑色素瘤TCGA表达数据验证PRL 1的促癌作用（图6 ABC）Cmpd-43能抑制人黑色素瘤细胞的增殖和迁移（图6 DE）。Cmpd-43也能降低HGF诱导的Erk1/2和Akt磷酸化（图6FG）。除了PRL 1，PRL 2和PRL 3也能形成三聚体结构，通过敲除起主要作用的PRL 1和PRL 2，发现细胞的ERK1/2 and Akt通路受到抑制（HI），说明Cmpd-43能够同时抑制PRL 1，PRL 2和PRL 3的活性。

图6 Cmpd-43对黑色素瘤细胞系MeWo.具有抑制作用

黑色素瘤小鼠模型实验，再次验证Cmpd-43通过抑制ERK1/2 and Akt通路，起到抑癌作用（图7）。

图7 Cmpd-43在体内抑制黑色素瘤移植瘤的生长